對于所有形式的色譜法，都存在與樣品負載相關的限制——質量和體積。這些是自變量，為了獲得zui佳結果，應單獨調查。在這篇文章中，我將討論增加溶劑體積對快速色譜分離的影響。
確定zui大加載體積的一個相關且關鍵的變量是溶解溶劑（樣品溶劑）的選擇。如果溶劑強度太高，則會導致峰變寬，并zui終導致產品損失，因為某些樣品會以 1 CV 與樣品溶劑一起洗脫。
正如之前的帖子中提到的，在可能的情況下，zui大限度地提高樣品濃度溶解溶劑中 ，以zui大限度地提高分離性能。
為了幫助說明溶解溶劑和進樣體積的作用，我將展示溶解在兩種不同溶劑，甲醇 (MeOH) 和二甲亞砜 (DMSO) 中的反應混合物的純化數據。
馬尿酸 (~0.5 g) 和 α-甲基芐胺 (~0.4 g) 在乙酸乙酯 (EtOAc) 中在 200 °C 下反應 10 分鐘，使用 Biotage Initiator+ 微波合成儀進行兩次。合成后，我將每個反應轉移到自己的 20 mL 閃爍瓶中，并使用 Biotage V-10 Touch 蒸發(fā)掉 EtOAc。
反應1產生932.5毫克，而反應2產生的總質量為 942.5 毫克。將反應1溶解在 MeOH 中至體積為5mL，而將反應2溶解在相同總體積的 DMSO 中。選擇這些溶劑是因為它們提供了完全的反應混合物溶解度。
在本研究中，我在Biotage Isolera Dalton 2000 上使用了 12 克 Biotage Sfar C18 色譜柱。12 克C18 色譜柱的柱體積 (CV) 為 17 mL。注射量需要根據CV的百分比來考慮，并應保持盡可能小。我選擇道爾頓2000系統(tǒng)是因為它能夠確定是否有任何反應混合物組分與溶解溶劑一起洗脫，這是體積過載的明顯跡象。
第1個測試使用了一個小的0.1mL上樣量 (~18.75 mg)，相當于色譜柱體積的0.6%。使用這個小體積，兩個樣品提供了相同的色譜，圖 1。 
圖 1. 上樣量為 0.1 mL (0.6% CV) 的反應混合物純化溶解溶劑的色譜比較。頂部 - MeOH 溶解的反應混合物。底部 - DMSO 溶解的反應混合物。
測試二將進樣體積增加到0.5mL (~93.75 mg)，等于色譜柱體積的 2.9%。在這里，我們可以看到甲醇樣品的峰開始變寬，但仍能提供出色的分離效果，圖 2。 
圖 2. 上樣量為0.5mL (2.9%) 的反應混合物純化的比較。頂部 - MeOH 溶劑化反應混合物。底部 - DMSO 溶劑化反應混合物。
在zui后一次測試中，進樣量加倍至1mL (~187.5 mg)。在此體積下，即色譜柱體積的 5.9%，甲醇樣品顯示出較大的分離度損失，這是由于較寬的峰以及在溶劑前沿洗脫的產物。然而，DMSO 樣品仍然產生了出色的分離效果，沒有產物與 DMSO 峰一起洗脫，并且有進一步增加負載的空間，圖 3。 
圖3. 1mL上樣體積（CV 的 5.9%）的色譜比較。頂部 - MeOH 溶劑化反應混合物，其中可以看到樣品穿透以及峰變寬和分辨率損失。底部 - DMSO 溶劑化反應混合物顯示沒有突破和完全分辨率。
如您所見，樣品溶劑的選擇對純化質量有重大影響。雖然甲醇的極性相當大 ( log P -0.77 )，但它是梯度中的強溶劑，限制了其加載體積范圍。另一方面，DMSO 極性很強（ log P -2.03 )并且是一種非常好的溶劑，DMF 也是一種極好的溶解溶劑選擇。 DMSO 廣泛的溶劑化特性和非常高的極性使其成為我想要zui大限度地提高負載和純化通量時的反相溶解溶劑的選擇。
如果您使用甲醇，甚至乙腈作為樣品溶劑，請將體積保持在色譜柱體積的 3% 以下。如果您將樣品溶解在 DMSO 中，您可以合理地期望在保持分離的同時至少將進樣體積和質量負載增加一倍。
